Grundlagen mikrobiologischen Arbeitens

Mikroorganismen

• Bacillus: hitzeresistenze Endosporen, Boden besiedelnd
• Bacillus stearothemophilus: Testkeim für Hitzestrilisation
• Bacillus subtilis: Heubazillus, Enzymproduzent (Amylasen, Proteasen)

Versuch 1: Herstellung mikrobiologischer Medien

Medienzusammensetzung

Baustoffe (g/l)	C, O, H, N, S, P, K, Ca, Mg, Fe
Spurenelemente (mg, microg/l)	Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, V, B, Cl, Na, Se, Si

• Je nach Stoffwechsel Energielieferant in Form von Kohlenstoff-, Stickstoff-, oder Schwefelverbindungen
• sowie anorganische und organische Wasserstoffdonatoren
• Suppline und Wachstumsfaktoren: Vitamine, Aminosäuren, Purine¹, Peptide
• alle Medien werden mit Wasser hergestellt

Gruppen von Nährmedien

Synthetische (=definierte) Medien	komplexe Medien
genau definierte Mengen an chemischen Zusätzen	nicht genau definierte Bestandteile für komplexe MO
	Peptone: durch Hydrolyse von tierischen/pflanzlichem Eiweiß, enthält Aminosäuren, Peptide, Salze, Vitamine und Zucker
	Hydrosolate: tierisches/pflanzliches Protein mit anorganischen Säuren, enthält freie Aminosäuren (Tryptophan zerstört)
	Extrakte: aus Fleisch enthalten Peptide, Purine, Harnstoff, Mineralien und Vitamine (frei von vergärbare Kohlenhydrate) Hefeextrakt: durch Autolyse/Hydrolyse von Back- und Brauhefen, enthalten Vitamine und Wuchsstoffe Malzextrakt: durch Auslaugung von Malz (55°C) enthalten Kohlenhydrate (Maltose), als Zusatz für Pilznährböden
	Säfte und Dekokte: wässrige Auslaugungen aus Erde, Früchten, Pferdekot
Minimalmedium	Vollmedium
Mindestansprüche der MO (z.B. prototrophe2)	enthalten auch Bestandteile, die der Organismus selbst herstellen kann, aber so das Wachstum zusätzlich fördern
Kollektivmedium	Selektivmedium
genügen Nährstoffanforderungen vieler MOs	nur gute Wachstumsbedingungen für eine kleine Gruppe, andere werden unterdrückt (Antibiotika)
Differentialmedien
erlauben mehreren Gruppen Wachstum, Zusätze können mit Stoffwechselprodukten wechselwirken
halbfeste/feste Medien
Agar: 45°C verfestigen, 95-100°C Schmelzen, kein Abbau durch MO Gelantine: 20°C verfestigen, ab 25°C flüssig, Abbau durch Exoprotease, kein Flüssigkeitsfilm Kieselsäure: nur anorganisch Caragen: vollsynthetisches Verfestigungsmittel Carrageenan: natürliches Verfestigungsmittel

Nährböden im Praktikum

Nährmedium	Bedeutung
Nährbouillon	NB-, LL?????
Standard I	hoher Glucoseanteil
Standard II	ohne Kohlenhydrate
Würze, Malzextrakt	hoher Zuckeranteil
Peptonwasser	hoher Peptonanteil
MRS-Bouillon	z.B. mit Lactosezusatz für Milchsäurebakterien, Lactobacillus-Agar nach DE MAN, ROGOSA und SHARPE

• Trockennährböden werden in Wasser gelöst -> Flüssignährboden
• Flüssignährböden werden mit Agar versetzt -> Festmedium
• nach Autoklavieren wird das Medium auf Böden oder Reagenzgläser verteilt
• Hitzeempfindliche Zusätze sollten erst nach Autoklavieren zugegeben werden
• bei zuckerhaltigen und aminosäurenhaltigen Nährböden erfolgt eine getrennte Sterilisation, sonst Maillard-Reaktion³

Sterilisationsmethoden

Abtöten lebender Organismen und/oder deren Sporen -> Verlust von Lebens- und Vermehrungsfähigkeit

1. Kaltsterilisation (Membranfiltration 5nm bis 10 microm)
2. Hitzesterilisation
   1. trockene Hitze (Sterilisationsschränke: 3 Std 150°C, 40min 180°C)
   2. feuchte Hitze (100°C strömender Dampf)
      1. Tyndallisierung (3x 30min 100°C, 24h 25-30°C Brütung)
      2. Dampfsterilisation (15min 121°C 1,2 bar)
      3. Pasteurisation (5-15min 70-80°C)
3. Desinfektionsmethoden
   1. Desinfektionsmittel (Aldehyde, Quarternäre Ammoniumverbindungen, Phenol, 10%iges Formalin, 70%iger Ethanol, 70%iges Isopropanol, Äthylenoxid (explosiv, für Kunststoff)
   2. UV-Bestrahlung (Wirkung nimmt mit Entfernung stark ab)

Versuchsdurchführung

1. 6ml vollständig gelöstes heißes Standard I Medium pro Reagenzglas (=12 ml insgesamt, es wurde vorher schon autoklaviert)
2. Autoklavieren
3. Schrägstellen der Medien und kalt werden lassen

Versuch 2: Sterilisationskontrolle

Theorie

Zwei Systeme zur Sterilsationskontrolle eines Autoklaven:

1. farbige Klebebänder, die bei genügend langer Exposition einen Farbumschlag machen
2. Sterikon-Bioindikator: Ampullen mit Bacillus stearothermophilus, die nach Autoklavieren bebrütet (24-48h) werden. Ansäurerung des Mediums durch Auskeimen von nicht abgetöteten Sporen (rot-violett -> gelb)

Versuchdurchführung

1. 3 Ampullen nach Anleitung in den Autoklaven, 1 zur Kontrolle draußen
2. dann bebrütung aller Ampullen (Auswertung am nächsten Tag)
3. Pipettendosen mit Klebebänder am Boden versehen und in die Trockensterilisation (3h bei 150°C)

Versuch 3: Einfluss verschiedener Sterilisationsmethoden auf Bacillus subtilis

Versuchsdurchführung

1. Beimpfen 1 Reagenzglas (Standard-I-Bouillon) 0,1ml Bacillus subtilis Sporensuspension
2. Beimpfen 1 Reagenzglas (Standard-I-Bouillon) 1 Tropfen Bacillus subtils Kultur
3. Bebrütung als Kontrolle
4. Auswertung am nächsten Tag: Wachstum -> Trübung

Versuch 4: Einfluss verschiedener Hitzesterilisationsmethoden auf hitzeempfindliche Medienzusätze

Theorie

• Zucker, Antibiotika, Vitamine und Wuchsstoffe sind hitzeempfindlich
• darum Sterilfiltration
• Reduzierende Zucker -> Maillard Reaktion -> Verfärbungen (Photometrische Messungen verfälscht) -> Reaktionsprodukte (MO können veränderte Substrate verstoffwechseln)

Versuchsdurchführung

1. Herstellung Fertigmedium Standard-II 2,5% + 1% Stärke (-> 0,05 ml Stärke werden gebraucht?)
2. Autoklavieren

Footnotes

1. Purin (R) ist eine heterobicyclische aromatische organische Verbindung mit vier Stickstoffatomen. Purine sind neben Pyrimidinen wichtige Bausteine der Nukleinsäuren. http://de.wikipedia.org/wiki/Purin

2. können alle Suppline (Wachstumsstoffe) selbstherstellen

3. zwischen Aminosäuren und reduzierenden Zuckern