Lmbt Skrip Enzym

1 Enzymtechnik

1.1 Theoretische Grundlagen

1.1.1 Einleitung

• Enzyme sind katalytisch aktive Proteine (d.h. makromolekulare Biokatalysatoren)

Hauptklassen der Enzyme
Klasse	Name	Beispiel
1	Oxidoreduktasen	Katalase
2	Transferasen	Hexokinase
3	Hydrolasen	alpha-Amylase
4	Lyasen	Pektinlyase
5	Isomerasen	Glucosephosphat-Isomerase
6	Ligasen	Pyrovatcarboxylase

1.1.2 Enzymkinetik

• Beschreibung des Geschwindigkeitsverhaltens
• Ein-Substrat-Reaktionen kommen nur selten vor. Meist tritt Wasser als zweites Substrat auf. Seine Konzentration ist nahezu konstant, darum die Annahme für Ein-Substrat-Reaktion
• Michaelis-Menten-Kinetik beschreibt die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration
• Reaktion 1. Ordnung: bei kleinen Konzentrationen hängt die Geschwindigkeit von der Konzentration ab
  Reaktion 0. Ordnung: Geschwindigtkeit ist unabhängig von der Substratgeschwindigkeit

Herleitung Michaelis-Menten-Gleichung nach Briggs und Huldane

(1)

\begin{align} E + S ~ \overset{k_{{}+1}}{\underset{k_{{}-1}}{\rightleftharpoons}} ~ ES ~ \overset{k_{{}+2}}{\rightarrow} ~ E + P \end{align}

(2)

\begin{align} - \frac{\mathrm{d}S}{\mathrm{d}t} = v = k_{{}+1} \cdot E \cdot S - k_{{}-1} (ES) \end{align}

(3)

\begin{align} \frac{\mathrm{d}(ES)}{\mathrm{d}t} = k_{{}+1} \cdot E \cdot S - k_{{}-1} (ES) - - k_{{}+2} (ES) \end{align}

Die Mengenbilanz $E = E_0 - (ES)$ und das Fließgleichgewicht $\frac{\mathrm{d}(ES)}{\mathrm{d}t} = 0$ kann in obige Gleichungen eingesetzt werden. Durch Auflösen nach $(ES)$ und einsetzen in Geschwindigkeitsgleichung erhält man $v$ und $K_M$.

(4)

\begin{align} v = \frac{k_{{}+2} \cdot S \cdot E_0}{S + \frac{k_{{}-1} + k_{{}+2}}{k_{{}+1}}} = v_{max} \cdot \frac{S}{S + K_M} \end{align}

(5)

\begin{align} K_M = \frac{k_{{}-1} + k_{{}+2}}{k_{{}+1}} \end{align}

• großes $K_M$ bedeutet schnnellen Zerfall
  kleines $K_M$ bedeutet schnelle Bildung
• $K_M$ ist unabhängig von der Enzymkonzentration
  $v_{max}$ ist abhängig von der Enzymkonzentration
• 1 kat = 1 mol/s 1 U = 1 µmol/min

Bestimmung von $v_{max}$ und $K_M$

• Bestimmung durch Variation der Substratkonzentration
• Ermittlung der Reaktionsgeschwindigkeit über Differenzquotienten v = \frac{\Delta p}{\Delta t}, idealerweise online
• bei Proben in Zeitintervallen Integration der Michaelis-Menten-Gleichung

(6)

\begin{align} v_{max} \cdot t = K_M \cdot \ln{\frac{S_0}{S}} + \left( S_0 + S \right) = - K_M \cdot \ln{(1 - U)} + S_0 \cdot U \end{align}

• bei Wertepaare nichtlineare Regression
• Überführung in lineare Form durch Variablentransformation

Lineweaver-Burke-Auftragung

(7)

\begin{align} \frac{K_M}{v_{max} \cdot S} + \frac{1}{v_{max}} \end{align}

Eadie-Hofstee-Auftragung

(8)

\begin{align} \frac{v}{S} = - \frac{1}{K_M} \cdot v + \frac{v_{max}}{K_M} \end{align}

1.1.3 Effektorkinetik

• Aktivatoren erhöhen Reaktionsgeschwindigkeit
• Inhibitoren verringern Reaktionsgeschwindigkeit

1.1.3.1 Kompetetive Hemmung

• Konkurrenz um das aktive Zentrum