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Inokulation

Als Inokulation wird in der Mikrobiologie das Animpfen einer Zellkultur oder einer Kultur mikrobieller Stämme (z. B. einer Gewebekultur oder Bakterienkultur) bezeichnet.

Inkubation

Anzüchtung beispielsweise von Zellkulturen oder Bakterienkulturen in einem Wärmeschrank

Impedanzverfahren

• Wachstum führt zu Veränderungen der chemischen oder ionischen Zusammensetzung des Mediums
• Kohlenhydrate keine Ladung und erhöhen Widerstand (Impedanz)
• Bei Verstoffwechselung nimmt Impedanz ab (je höher Zellzahl desto schneller)
• Nachteile: langsam wachsende MO → langsame Stoffumwandlungen

ATP-Biolumineszenz

• Messung ATP-Menge über Lichtintensität
• Vorteil
  • sehr schnell
  • qualitativer und quantitativer Nachweis minimaler Mengen (10^-11 Mol)
• Nachteil
  • unspezifisch
  • nicht feststellbar, ob ATP vom Bierschädling kommt, aber Beurteilung des Hygiene-Status möglich

Immunchemischer Nachweis

• Prinzip: Antigen-Antikörper-Reaktion
• Bakterien binden an fixierte Antiköprer
• zweiter Antikörper mit Färbeenzym, welches nach Zugabe von farblosen Chromogen, die Reaktion zum farbigen Produkt katalysiert
• Photometrische Messung

Durchflusszytometrie

• Zellen in Kapillare einzeln durch Lichtstrahl (Laser, Argon, Xenon)
• Messung des gestreuten Lichts → Zellform, Komplexität, Größe
• Messung mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe, die spez. an Zellbestandteilen hängen
• Häufigkeitsverteilung auf Dot-Spot Diagrammen oder Histogrammen
• Immunfluoreszenzmarkierung: Antikörper (mit Fluoreszenzfarbstoffen) binden an spez. Bakterien (Operflächenproteine)
• Vorteile
  • sehr empfindlich (wenige Bakterien in Hefepopulation)
• Nachteile
  • nur kleine Probemengen
  • Gerät und Verbrauchsmaterialien sehr teuer

Gensonden-Technologie

• fluoreszenzmarkierte Gensonden (einzelsträngige DNA-Moleküle mit stammspez. Basensequenz) binden an komplementäre rRNA-Zielsequenz → Leuchten der Bierschädlinge

Direkte Fluoreszenzfärbung

• FDA Fluorescindiacetat fluoresziert grün in lebenden Zellen (Spaltung durch Esterasen)
• PI Propidiumjodid fluoresziert rot in toten Zellen
• Vorteile
  • große Geschwindigkeit
  • automatische Auswertung

Sandwich-Hybridisierung

• Nachweis von mikroorganismenspez. rRNA mit art-, gruppen- und gattungsspezifischen Fänger- und Nachweissonden durch Sandwich-Hybridisierung
• Fängersonde Festphase -> Detektionssonde (Bindung mit Enzym, welches Farbreaktion katalysiert)
• Analysenzeit 2-2,5 Stunden
• Vorteile
  • schnell und sensitiv
  • qualitative und quantitative Erfassung lebender Zellen
  • hochflexibel
    • Bestimmung von rRNA und mRNA
    • kombinierbar mit verschiedensten Auslesetechnologien
  • robuste und preiswerte Gerätetechnik, kosteneffiziente Analysen
  • schnelle, preiswerte und gut planbare Testentwicklung
    • Spezifität der Sonden gut vorhersagbar
    • kostengünstige, einfache Herstellung der Oligosonden

PCR

• klassische Differenzierung (Selektivnährmedien, Mikroskopieren)
  • hoher Zeitaufwand
  • Ergebnis nicht immer deutbar
  • von Anzuchtbedingungen abhängig
  • voherige Vereinzelung notwendig
  • Nachweisdauer von bierschädlichen Bakterien 5-7 d meist zu lang
• Ziel: Erhöhung der Nachweisgeschwindigkeit (Zell-DNA in wenigen Stunden)

molekulare Grundlagen

• 4 Nucleobasen: Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin
• 2 komplementäre Stränge in 5'-3' Richtung

DNA-Synthese

• DNA-Vermehrung: DNA-Replikation von Chromosomen und Plasmiden
  • Helikasen → Aufdrillen und Auftrennen DNA-Doppelstrang
  • DNA-Polymerasen → Neusynthese in 5'-3'-Richtung
• künstliche DNA-Vermehrung durch PCR
  • thermische Aufspaltung
  • Definition Zielsequenz
  • Vermehrung durch Polymerase
  • mehrfache Wiederholung (Kettenreaktion)

PCR-Reaktionsschema

• spez. DNA-Segmente der Zielorganismen werden in vitro exponentiell vervielfälltigt
• Auswertung durch An- oder Abwesenheit von PCR-Produkten (Ziel-DNA)

1. 94 °C 10 min: Aktivierung Polymerase
2. 94 °C 15 sec: Aufbrechen Doppelstrang
3. 60 °C 30 sec: Annealingtemperatur für Primer, Anlagerung der Primer
4. 72 °C 30 sec: Temperaturoptimumg Polymerase → Anhängen der dNTP's an Primer

• Zyklus ca. 40 Wiederholungen

Standard-PCR

• Gelelektrophorese der PCR-Produkte
• Visualisierung über Agarosegel (Ethidiumbromid) oder Polyacrylamidgel
• Brauereianwendung seit ca. 1992

Realtime-PCR

• Online-Messung über Fluoreszenzsonden während PCR-Lauf
• Brauereianwendugn seit ca. 2001
• pos. Ergebnis → sigmoider Kurvenansteig Ct-Wert zwischen 1-40

TaqMan

TaqMan Sonde

eine Sonde mit zwei Flurophoren (R+Q)

• Sonde lagert sich an DNA an und wird währen Polymerase-Aktivität zerstört
• bei Trennung von R+Q ensteht das Reporter-Signal (R) → Fluoreszenzanstieg

LightCycler

LightCycler Sonden

zwei Sonden, jede Sonde trägt einen Farbstoff

• Anlagerung beider Sonden in enger Nachbarschaft
• Abstrahlung des Signals nur wenn beide gebunden sind
• proportionale Zunahme der neugebildeten DNA während PCR
• Schmelzkurvenanalyse (Fluoreszenz vs. Temperatur) während PCR-Lauf

PCR in Praxis

• Probenvorbereitung: evtl. Membranfiltration, evtl. Voranreicherung
• DNA-Isolation: Lysepuffer → Aufschluss der Zellen
• PCR-Reaktion: DNA Zugabe zum Reaktionsmix, PCR-Reaktion im Thermocycler
• Reaktionsmix
  • dNTP's: Desoxynucleotid-Triphosphate DNA-Bausteine
  • Puffer
  • Primer
  • Salze
  • Ziel-DNA
  • Polymerase
  • Wasser

Anwendung in Brauerei

(gestrichen)