Kultivierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

Flüssige Kulturen

• Anwendung
  • Anreicherung und Vermehrung von MO (optimales Nährstoffangebot, Belüftung)
  • physiologische Tests
  • Erfassung von Wachstumsverhalten
• Wachstumsbilder
  • Trübung → gleichmäßig, Schlieren
  • Bodensatz → locker, fest, flockig, körnig, schleimig
  • Oberflächenwachstum (aerobe Keime)
    • Ringbildung
    • Hautbildung → Pallisaden, Dachziegel
      Kahmhaut: innerhalb 3 d bei 25-30 °C
    • Inselbildung → CO₂-Bildung → Aufsteigen einzelner Zellverbände
  • Gasbildung

Feste Kulturen

• Anzucht auf festen Agarnährböden → jede Zelle bildet örtlich fixierte Kolonie
• Anwendung
  • Nachweis von MO
  • Isolierung → Einzelkolonie → Reinkultur
  • Keimzahlbestimmung
  • Stammhaltung
  • Färbepräparate
  • Koloniemorphologie → taxonomisches Merkmal
  • direkte Differenzierungstests

Kolonieformen

Platten- und Reagenzglaskulturen

Plattenkulturen

• Petrischalen (5,5/9/14 cm) Gießtemperatur 50 °C, Deckel mit Nocken für Gasaustausch, aerobe Inkubation, anaerobe Inkubation → Anaerbiosetopf
• Ausstrischplatte
  • Isolierung Einzelkulturen
  • Stammhaltung von Arbeitskulturen
  • mit Impföse
• Aussgussplatte = Spatelplatte
  • Keimzahl (Titer-) und Keimtypenbestimmung
  • Isolierung von Einzelkulturen
  • physiologische und cytologische Tests
  • Gewinnung von Zellmaterial
  • Verteilung von Zellsuspensionen mit Drigalskispatel
  • Klatsch- und Färbepräparate
• Gussplatte
  • Keimgehalt in Probe
  • Keimzahlbestimmung
  • Ansatz Nähragar 44 °C: Probe + NA in RG mischen und ausgiessen oder Probe in Schale und NA dazu und mischen → Oberflächen- oder Submerskulturen (aerob/anerob)
• Membranfilterkultur
  • MF 0,20/0,45 µm Porengröße/Gitternetz
  • Keimgehalt in filtrierbaren Proben
  • Keimzahlbestimmung
  • Spurennachweis
  • MF auf Agarplatte legen → quantitative Auswertung durch Koloniezählen
  • MF in Nährlösung → Trübung → qualitativer Nachweis

Reagenzglaskultur

• im Kühlschrank lange haltbar, geringer Platzbedarf
• Schrägagarkultur
  • größere Agaroberfläche, wellenförmiger Ausstrich (Impföse)
  • Stammhaltung Aerobier (Bakterien, Hefen, Schimmelpilze)
  • Überimpfperioden: Bakterien → 4 Wochen, Hefen + Schimmelpilze → 3 Monate
• Stichkultur
  • Stammhaltung für Anaerobier, fakultativ anaerobe Keime
  • Impfnadel (Überimpfen nach 4-12 Wochen)
  • Stichkanal (Verhalten gegenüber O₂) → Wachstumszonen
    • strikte Aerobier: nur Oberfläche
    • aerophile Keime: Oberfläche, oberer Bereich
    • fakult. Anaerobier: gesamter Kanal, nach unten weniger
    • mikroaerophile Keime: besonders mittlerer und unterer Bereich
    • strikte Anaerobier: nur unterer Bereich
  • Gasbildung: Risse, Zerklüftungen, Anheben
• Schüttelagarkultur
  • Kultivierung mäßig anaerober und fak. anaerober MO
  • Austreiben von O₂
  • Wachstumsbild je nach Sauerstofftoleranz → Parafinverschluss
• Weichagarkultur
  • 0,02-0,3 % Agar → halbfeste Konsistenz
  • Stichkultur zeigt unbewegliche von beweglichen MOs → strichförmiges/diffuses Wachstum (Trübung)

Anaerobe Kultivierung

• Entfernung O₂ im Medium und Umgebung durch chemische und physikalische Methoden
• Oxidationsschutz: stark reduzierende Substanzen (Natriumthioglycolat, L-Cystein bzw. Cysteinhydrochlorid, Ascorbinsäure, Natriumsulfid, Natriumsulfit)
• Sauerstoffindikatoren: Methylenblauindikatorstreifen (weiß → anaerob, blau → aerob)
• Methoden
  • Hochschichtagar
    6-8 cm in RG, 10 min kochen → O₂ austreiben, schnell abkühlen, Abschluss mit flüssigem Parafin, Beimpfen mit Impfnadel
  • Methode nach Wright und Burri
    Schrägagarkultur, darüber steriler Wattestopfen + Wattestopfen mit Pyrogallollösung (reduzierende Wirkung von Pyrogallol im alkalischen Milieu) + Luftdichter Verschluss
  • Anaerobiose Topf
    • Umsetzung von Sauerstoff am Palladiumkatalysator mit Wasserstoff (NaBH₄ als Quelle) → kalte Knallgasreaktion
    • Oxidation von Eisenpulver in Kieselgur als Trägermaterial
    • CO₂ als Reaktionsstarter Na₂CO₃ + Säure + Wasser → CO₂
    • Indikator Methylenblau
    • Problem: Membranfilter enthält O₂ → CO₂-Spülung)
    • Systeme: Gas Pak, Anaerocult, Gas-Generating-Kit
  • Physikalischer Luftaustausch (Exsikkator mit 2 Hähnen, Vakuum-/Wasserstrahlpumpe, Begasung CO₂/N₂)
    • Vorteil: billig, jederzeit Entnahme möglich
    • Nachteil: Keimverschleppung

Vermehrung und Wachstum

Zellzahl- und Zellmassebestimmungen

• Direkte Methoden
  • Zählmethode/Zählkammer
    • homogen gemischte MO-Suspension auf Zählkammer (16 Großquadarte x 16 Kleinquadrate = 256 KQ)
    • Tiefe 0,1 mm für Hefe (Hauser-Petroff-Kammer) 0,02 mm für Bakterien (Thoma-Kammer)
    • kombiniert mit Methylenblautest (min. 200 Zellen)
      → Lebend-Tot-Anteilbestimmung (blau = tot)
      → Viabilitätsmessung
  • Coulter Counter
    • Zelle durch Kapillaröffnung → Erhöhung elektrischer Widerstand → Impuls
    • Impulsintensität Aussage über Zellgrößenverteilung
    • genaue und schnelle Methode
• Indirekte Methoden
  • Turbidimetrie → Messung opt. Dichte als Extinktion
  • Nephelometrie → Streulichtmessung (Eichkurven für verschiedene MO)
  • Bestimmung Trockenmasse, N- oder C-Gehalt
  • Bestimmung charakteristische Stoffwechselprodukte → O₂-Aufnahme, CO₂-Bildung, Säureproduktion
    Brauerei: CO₂-Bildung/Zeit → Zellmasse/Gäraktivität

Ermittlung Lebendkeimzahl

• Hygieneuntersuchungen, biologische Stabilität von Getränken
• Gussplattenkulturen + Spatelplattenkulturen (z.B. TVO, MTV)
  • nährstoffreiche, peptonhaltige, hefeextrakthaltige Medien (Kollektiv-, Selektiv-Nährböden)
  • Medien aufkochen, auf 45 °C temperieren → ausgießen
  • Ermittlung Koloniezahl: 30-300 (50-60 optimal)
• Membranfiltermethode (z.B. Bier, Wasser, Wein)
  • Porenweite 0,2/0,45 µm, blasenfrei
  • nach Filtration auf Agarplatte legen
• Dezimale Verdünnungsreihe
• MPN-Methode (Most Probable Number)
  • üblich in Lebensmittelmikrobiologie (Nachweis Enterobacteriaceae, E. coli)
  • 3 verschiedenen Verdünnungen in Lactose-Bouillon + Durham Einsatz + pH-Indikatorfarbstoff oder MacConkey-B, BRILA zu 3 RG paralell beimpft
  • Auszählen positiver Röhrchen (Trübung, Gasbildung, Säurebildung) → Bestimmung wahrscheinlichen Keimgehalts aus statistischen Tabellen
• Titer-Verfahren
  • kleinste Probemenge in ml, in der MO gerade noch nachweisbar sind → Dezimale Verdünnungsreihe, Flüssigmedien
  • TITER = niedrigste Verdünnungsstufe mit Wachstum
  • Titerverfahren für feste Proben: Bebrütung verschiedener Mengen → Aussage wieviele Keime sich in welcher Menge befinden können

Physiologisch-Biochemische Tests

• GRAM-Verhalten (Schlüsseltest)
  • Gram-negativ MO: einschichtige Zellwand
  • + KOH (5 %ig) Kolonien mit Impföse verrühren → Schleimbildung (fädenziehend)
• Oxidase-Test (Schlüsseltest)
  • Sauerstoff als Elektronenakzeptor (Energiegewinnung), Cytochrom-Oxidase katalysiert Reaktion
  • Bierschädlinge sind immer Oxidase-negativ, aber auch nicht schädliche gram-neg. Bakterienarten
  • Blaufärbung von Teststreifen (Kovacs- oder Nadi-Reagenz) bei Oxidase-positiv
• Indol-Bildung
  • Abbau von Tryptophan zu Indol (E. coli auf St. II-B)
  • 1-3 d bei 38 °C im RG + Kovacs-Indolreagenz → purpurroter Ring → positiv
• Katalase-Test (Schlüsseltest)
  • Katalase bei Aerobiern
  • O₂ → O₂^2-+ 2 H⁺ → H₂O₂ → Katalase → H₂O + 1/2 O₂
  • Aufschäumen positiv
• Schwefelwasserstoffbildung
  • Identifizierung bei Enterobacteriaceen (z.B. Salmonellen)
  • St. I-Medium + Natriumthiosulfat + Ammoniumeisen(III)-citrat
  • bei H₂S-Bildung → Ausfällung schwarzes Eisensulfid
• Voges-Proskauer-Test (VP-Test)
  • Nachweis Acetoin, 2,3-Butandiol, Diacetyl
  • Wachstum in Glucosehaltiges Medium → Kultursuspension + Kreatin + a-Naphthol + KOH → Rotfärbung nach Schütteln → positiv
  • Differenzierung E. coli und coliforme Bakterien (Bierschädlinge Pediococcus damnosus, Lactobacillus casei)

Färbemethoden

• Fluoreszenz-Färbung mit Acridinorange
• Geißel-Färbung (Leifson oder Gray)
• Gram-Färbung
  • einschichtig → gram-neg. mehrschichtig → gram-pos.
  • Färben mit Kristallviolett, Beizen Lugol'scher Lösung, Waschen Ethanol, Gegenfärbung Safranin, Waschen und Trocknen
  • Hellfeld mit Ölimmersion (blau → gram-pos, rot → gram-neg.)
• Kapselfärbung nach Novelli
• Membranfilter-Mikrokolonie-Fluoreszenz-Methode (MMCF-Methode)
• Methylenblau-Färbung
  • 2 Theorien
    • lebende Zellen: schlechte Permeabilität für MB → keine Färbung, tote Zellen: gute Permeabilität wegen defekter Cytoplasmamembran → Blaufärbung
    • lebende Zellen: Oxidation von MB in farbloses Leuco-Methylenblau → keine Färbung, tote Zellen: keine Umwandlung → Blaufärbung
  • Lebend-Tot-Nachweis von Brauereihefen
    • MB-Lösung + Pufferlösung (Trinatriumcitrat/Kaliumphosphat) mit Hefesuspension mischen
    • Auszählen im Hellfeld (ca. 50 Zellen/Gesichtsfeld, 20 Gesichtsfelder)
• Negativfärbung (Schleimhüllen- und Kaspelfärbung)
• Sporenfärbung
  • Vorkultur: nährstoffarmer Natriumacetat-Agar
  • Ausstrich an Flamme fixiern, mit Malachitgrün versetzen und mehrmals verdampfen lassen, Abspülen, Differenzieren in Alkohol, Abspülen, Gegenfärben mit Safraninrot, Abspülen und Trocknen
  • Hellfeld mit Ölimmersion → Sporen Grün Zellen Rot
  • auch für Ascosporenfärbung für Hefen geeignet

Identifizierung von Mikroorganismen

• klassische Verfahren
  • Zellmorphologie
  • Koloniemorphologie
  • physiologisch-chemische Merkmale
  • Stoffwechselprodukte
• moderne Verfahren
  • Zellwandtyp (Peptidoglycan, Murein)
  • Enzymcharakterisierung (elektrophoretische Mobilität)
  • Proteinmuster (Elektrophorese, immunologische Tests)
  • Guanin + Cytosin-Gehalt der DNS)
  • DNS/DNS-Homologie
  • Sequenzierung
• Bedeutung für Getränketechnologie
  • grobe Differenzierung ausreichend → Schädlichkeitskategorien
  • genaue Identifizierung in speziellen Fällen
    • Ermittlung von Infektionsquellen
    • gezielte Desinfektionsmaßnahmen
    • Filtrationseffizienz
    • Pasteurisations-Einheiten
    • Anfälligkeit von Getränken

Identifizierungsspektrum für Hefen

• Vergärung von Kohlenhydraten (Basis-Medium ohne C-Quelle + Durham-Einsatz + C-Quelle → Wachstum, Trübung, Gasbildung)
• Assimilations-Test von Kohlenhydraten (Basis-Medium ohne C-Quelle + jeweilige C-Quelle → Wachstum, Trübung)
• Assimilation von N-Verbindungen (Basis-Medium ohne N-Quelle + Nitrat, Nitrit, Ethylaminhydrochlorid, Cadaverinhydrochlorid, L-Lysin)
• weitere Tests
  • Wachstum im vitaminfreien Agar
  • Wachstum auf 50 % Glucose-Agar
  • Wachstum mit 10 % NaCl
  • Wachstum bei 37 °C
  • Wachstum mit 100 und 1000 ppm Cycloheximid
  • Urease-Test

Identifizierungsspektrum für Milchsäurebakterien

• Bedeutung als Kulturstämme, Starterkulturen, Bierschädlinge
• Vergärung verschiedener C-Quellen (MRS ohne Zucker, SHARPE-Medium + Chlorphenolrot + 1 % jeweilige C-Quelle)
• Weitere Tests
  • Gas-Bildung (Durham-Einsatz)
  • Milchsäurekonzentration
  • Wachstumstoleranzen (Temperaturen, pH, NaCl-Konzentration)
  • Alkoholtoleranz
  • Arginin-Spaltung
  • Hippursäure-Spaltung
  • Acetoin-/Diacetyl-Bildung