Kapitel 1: Einleitung - Sterilisation - Zellmorphologie

Gefährundsklassifizierung von Mikroorganismen

Gruppe 1	Fehlendes oder geringes Risiko für die Beschäftigten, die Bevölkerung und Haustiere
Gruppe 2	Mäßiges Risiko für die Beschäftigten. Geringes Risiko für die Bevölkerung und Haustiere
Gruppe 3	Hohes Risiko für die Beschäftigten. Geringes Risiko für die Bevölkerung. Nicht heimische Erreger für Haustiere mit unbekannten Risiko
Gruppe 4	Hohes Risiko für die Beschäftigten. Hohes oder unbekanntes Risiko für die Bevölkerung und Haustiere

Laborausstattung (Übersicht)

• Mikroskop
• Brutschränke
• Autoklav
• Membranfilter
• Gasbrenner, Impföse
• Glaswaren
• Petrischalen

Sterilisation und Desinfektion

• Steril oder keimfrei bedeutet
  • frei von vermehrungsfähigen Mikroorganismen
  • einschließlich deren Ruhestadien oder Dauerformen (z.B. Sporen)

Sterilisation

• Beseitigung oder Abtötung aller MO (auch Inaktivierung Vieren), abgetötete Keime verbleiben mit sterilisierten Gut
• Vorraussetzung für mikrobiologisches Arbeiten
• Sekundärinfektion vermeiden für Aussagekraft
  • mangelhafte Arbeitstechnik
  • infizierte Gefäße, Arbeitsgeräte, Nährmedien
  • Umgebungsluft
  • Probenehmer
• Abtötung durch Hitze
  • Denaturierung Zellproteine, Oxidation intrazelluläre Bestandteile (trockene Hitze)
  • Parameter
    • Art der Mikroorganismen
    • Alter und Funktionszustand (vegetative Zellen oder Sporen)
    • Milieubedingungen (pH-Wert)
    • Ausgangskeimzahl
  • Feuchte Hitze ist effektiver als trockene Hitze
  • D-Wert (dezimale Reduktionszeit) = Zeit, die erforderlich ist, um unter genau definierten Bedingungen (z.B. bestimmte Temperatur) die Ausgangskeimzahl um einer 10er Potenz herabzusetzen
  • Sterilisation durch trockene Hitze
    • Vorteile
      • keine Korrosion
      • kene nachträgliche Trocknung
    • Nachteile
      • Luft schlechter Wärmeleiter → Kaltluftpolster vermeiden
      • Temperatur des Sterilgutes hinkt oft beträchtlich hinterher
    • Verfahren 2 h bei 180 °C oder 5 h bei 150 °C (Watte/Sterilstopfen) reine Sterilisationszeit
    • Überbelegung vermeiden
  • Sterilisation durch Ausglühen oder Abflammen
    • Bunsenbrennerflamme: hellblauer Innenkegel (300 °C, reduzierend), dunkelblauer Außenkegel (1500 °C, oxidierend)
    • Ausglühen
      • Impfösen, -nadeln bis Gelbglut ausglühen
      • hochwirksam, Material stark angreifend, vor Gebrauch abkühlen
    • Abflammen
      • Benetzung mit 96 %-Ethanol
      • für Pinzetten, Drigalskyspatel, Membranfiltrationsvorrichtungen
      • nur overflächlich, Verbrennungsprodukte stören MO-Wachstum
  • Sterilisation durch feuchte Hitze
    • D-Wert_{trocken, 121 °C} = 15-30 min → D-Wert_{feucht, 121 °C} = 1-3 min
    • Autoklavieren
      • einzig zuverlässiges Sterilisationsverfahren, Abtötung von Endosporen
      • Aufheizen auf 100 °C, Druckaufbau in 15 min auf 1 bar → T steigt 121 °C
      • Sterilisationsgut nimmt Dampftemperatur an, Ausgleichsphase (10 min)
      • eigentliche Sterilisation, Haltephase (15-20 min)
      • Abkühlphase (15 min)
      • je größer das Volumen, desto länger ist die Ausgleichszeit
    • Tyndallisation
      • mehrmaliges Erhitzen auf 100 °C im Dampftopf, dazwischen Bebrütung um Sporen auszukeimen, die dann wieder abgetötet werden → umständlich, zeitraubend
      • für nährstoffreiche, keimarme Medien, die Autoklavieren nicht vertragen (Vitamine, Zucker, Antibiotika)
• Kaltsterilisation
  • Oberflächen- oder Tiefenfilter (Zellulose, Glas-, Kunstfasern, Glassinter, Keramik, Kieselgur)
  • Filtration durch Über- bzw. Unterdruck
  • Porengröße 0,2 µm bis 0,45 µm
  • Keimabscheiderate = 10⁷ Z/cm² Filterfläche
  • für hitzeempfindliche Flüssigkeiten (Zucker + Proteine), für Gase (Sterilluft)
• Sterilisation von Oberflächen
  • UV-Strahlung
    • nicht-ionisierend bei 260-280 bzw. 185 nm
    • nur geringe Eindringtiefe
    • nur zur Keimreduzierung von Luft und Oberflächen (Sterilbänke)
    • verursacht strukturelle DNA-Veränderungen
    • Einsatz in unbenutzten Räumen über Nacht
    • kann Kunststoffe angreifen
  • Gase
    • Ethylenoxid → eingetütete Petrischalen, Reaktionsgefäße
    • hochgiftig → kein Laboreinsatz, nur technischer Maßstab
• Kontrolle der Sterilität
  • Stichproben
    • Medien: Bebrütung 3 Tage bei 28 °C, 2 Tage Raumtemperatur
    • Glaswaren: Ausspülen mit Nährmedien, Bebrüten 3 Tage bei 28 °C
    • Verdünnungsflüssigkeiten: Gussplatte → 2 ml Untersuchungsflüssigkeit mit Nährboden aufgießen und bebrüten
    • Arbeitstische + Oberflächen: Wischproben in Nährmedium und bebrüten, Abklatschpräparat
  • während Sterilisation
    • Thermoindikatoren, Indikatorbänder, Etiketten
    • Bioindikatoren
      • Teststreifen Sporen Bacillus subtilis, Bebrütung 7 Tage bei 37 °C
      • Testampullen Bacillus stearothermophilus, Bebrütung 2 Tage bei 60 °C → Farbumschlag oder Trübung, Kontrolle mit nicht sterilisierter Ampulle

Desinfektion

• ist die selektive Abtötung bzw. irreversible Inaktivierung aller Keime an und im kontaminierten Objekt
• nur Keimreduzierung (99,999 %)
• Wirkung abhängig von Verschmutzung, pH, Temperatur
• Händedesinfektion: 60-80 % Keimreduktion (Alkohol-Basis)
• Arbeitsflächen: Alkohol-Basis oder Formaldehyd
• Gerätedesinfektion: 1 h Desinfektionsbad Peroxyessigsäure oder Glutaraldehyd

Arbeiten mit Getränkeorganismen

• Vorraussetzung steriles Arbeiten und Erfahrung
• wichtig: Reinkulturen, Nährmedien/Kulturmethoden, Inkubationsbedingungen
• Kriterien
  • Zellmorphologie: mikroskopische Analyse
  • Koloniemorphologie: Wachstumseigenschaften, Kultivierung
  • physiologisch-biochemische Eigenschaften: phänotypische Merkmale
  • Stoffwechselprodukte
  • cytochemische Eigenschaften: Zellwand, Färbemethoden
  • genotypische Merkmale: Chromosomenausstattung, DNA-GC-Gehalt, DNA/DNA-Homologie, DNA-Sequenzen, DNA-Sonden

Zellmorphologie Bakterien, Hefen und Schimmelpilze

• Stäbchenförmige Bakterien
  • Kokkoide Stäbchen
  • Kurzstäbchen
  • Langstäbchen (Länge > 2x Breite)
  • Spirillen (starr)
  • Vibrionen
  • Spirochäten (flexibel)
• Kokkenförmige Bakterien
  • Monokokken, Diplokokken (z.B. Micrococcus): Teilung nach einer Richtung des Raums
  • Ketten (z.B. Streptococcus): Teilung nach ener Richtung
  • Tetraden (z.B. Pediococcus): Teilung nach zwei Richtungen
  • Platten (z.B. Micrococus): Teilung nach zwei Richtungen
  • Pakete (z.B. Sarcina): Teilung nach drei Richtungen
  • Haufen (z.B. Staphylococcus): Teilung nach drei Richtungen
• Wachstumsformen
  • Kettenbildung (z.B. Lactobacillus casei, Lactobacillus lindneri)
  • Fadenbildung (z.B. Lactobacillus brevis)
  • Gekrümmte Stäbchen (z.B. Lactobacillus curvatus)
  • Corynefome Bakterien (z.B. Lactobacillus coryniformis)
  • Kaspelbildung (z.B. Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus frigidus)
  • Zellagglomerate (z.B. Enterobacter agglomerans)
  • Pallisadenanordnung (z.B. Bacillus subtilis)
  • Pleomorphismus (z.B. Arthrobacter sp.)
  • Involutionsformen, Irreguläre Zellformen
  • Sporenbildung (z.B. Bacillus sp.)
• Begeißelung von Bakterien
  • Monopolar monotrich
  • Monopolar polytrich (lophotrich)
  • Bipolar polytrich (amphitrich)
  • Peritrich
  • Lateral polytrich
• Bakterielle Endosporen
  • Zentral, Form Mutterzelle erhalten (z.B. Bacillus megaterium)
  • Zentral, Mutterzelle aufgetrieben = Clostridium-Form (z.B. Bacillus polymyxa)
  • Terminal, Form Mutterzelle erhalten (z.B. Bacillus thuringiensis)
  • Terminal, Mutterzelle aufgetrieben (z.B. Clostridium perfringens)
  • Terminal, Mutterzelle aufgetrieben, Spore rund = Plectridium-Form (z.B. Bacillus sphaericus)
  • Lateral, Mutterzelle aufgetrieben (z.B. Bacillus laterosporus)
  • Subterminal, Mutterzelle aufgetrieben (z.B. Clostridium acetobutylicum)
• Vegetative Vermehrung von Hefen
  • Sprossung: häufigste Vermehrungsform = inäquale Teilung (z.B. Saccharomyces)
  • Sprossung und Spaltung (nur bei Saccharomycodes)
  • Spaltung: äquale Teilung (nur bei Schizosaccharomyces)
  • Sparriger Sprossverband (z.B. Saccharomyces cerevisiae)
  • Geradliniger Sprossverband (z.B. Saccharomyces cervisiae ssp. ellipsoideus)
  • Sprossmycel = Pseudomycel: unechte Verzweigungen (z.B. Candida)
  • fadenförmiges Pseudomycel (Pseudohyphen) (z.B. Brettanomyces anomylus)
• Sprossungstypen von Hefen
  • Schultersprossung (z.B. Saccharomyces cerevisiae)
  • Wegweiserform (z.B. Saccharomyes pastorians)
  • Multilaterale Sprosung (z.B. Saccharomyces)
  • Kronensprossung (z.B. Debaryomyces hansenii)
  • polare, bipolare oder apikale Sprossung (z.B. Saccharomyces ludwigii, Kloeckera apiculata)
  • allseitige Sprossung (z.B. Debaryomyces hansenii)
  • ogivale Sprossung (z.B. Brettanomyces)
  • Trianguläre Sprossung (z.B. Trigonopsis)
  • aeroplane Sprossung (z.B. Candida reukauffii)
  • Kreuzsprossung (z.B. Candida reukauffii)
• Echte Myzelien bei Euascomyceten

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