Kapitel 1+2: Brau- und Gärungshefen

Einleitende Bemerkung

Nährmedium wird angeimpft (Inokulation = Anstellen) und während Hauptgärung, Reifung und Lagerung entstehen die Produkte Hefe, CO₂ und Bier.

Viabilität

erfassbarer prozentualer Anteil lebender Zellen

Vitabilität

Erfassung der Stoffwechselaktivitäten (Gärgeschwindigkeit, metabolische Aktivität) und Widerstandsfähigkeit gegenüber Stresszuständen

Hefemanagement

Umgang mit Betriebshefe

Hefereinzucht, Hefepropagation

je nach Volumenbereich und technischen Bedingungen

Zellzahl

g/l oder Mio Zellen/ml

Teilprozesse

• Anstellen (0,5-1 d)
• Gärung und Reifung (6-13 d)
  • viele biochemische Reaktionen mit vielen Zwischen- und Endprodukten
  • Abbau Jungbukettstoffe und Bildung Aromastoffe
• Klär- und Lagerphase (4-8 d)
  • Absetzen/Steigen der Hefe
  • Abklärung Eiweiß/Gerbstoff-Kolloide

Hefenährstoffe

• Kohlenhydrate (Zucker)
• Stickstoffquellen (Aminosäuren)
• Anorganische Substanzen (Mineralstoffe)
• Sauerstoff
• Vitamine, Fettsäuren, Sterole

Brau- und Gärungshefen

Kulturhefen Gärungs- und Getränkeindustrie

Saccharomyces cerevisiae
untergärig	obergärig	Brennerei	Backhefe	Weinhefe
Sachh. carlsbergensis, S. uvarum, S. pastorianus	Saccharomyces cerevisiae (unterschiedliche)			S. cerevisiae, S. ellipsoideus, S. uvarum, S. bayanus

Ernährungsweise S. cerevisiae

• Energiequelle: Oxidation (an)organischer Verbindungen → chemotroph
• Wasserstofdonator: Organische Verbindungen → organotroph
• Kohlenstoffquelle: Organische Verbindungen → heterotroph
• Energiegewinnung: Substratkettenphosphorylierung + oxidative Phosphorylierung → Atmung + Gärung
• Sauerstoffbedarf: fakultativ anaerob/aerob

Unterschiede UG/OG

Kriterium	untergärig	obergärig
Größe, Form, Zellinhalte	kein Unterschied
Sprossverbände, Agglutinationsvermögen (Verklumpung)	lockere nur wenige Zellen umfassend, geringes Aggl. Verm.	bildet am Ende der Gärung Verbände (ca. 8 Zellen), kein Aggl. Verm.
max. Wachstumstemp.	31-34 °C	38-40 °C
opt. Wachstumstemp.	27-30 °C	30-34 °C
GNP	weniger fruchtig und aromatisch	deutlich mehr (höhere Alkohole, Ester, fl. Phenole, S-Verbindungen)
Temperatursensitivität	Wachstum/Gärung bei tiefen Temp.	empfindlich < 10 °C, sedimentiert
Raffinoseverwertung	vollständig (Invertase, Galactosidase)	Raffinose zu 1/3, Melobiose nicht, keine Galactosidase
Verhalten am Gärende	agglomeriert und setzt sich ab	CO2-Auftrieb steigt auf
Sporenbildungsvermögen	gering	Sporolationsfreudig
Atmungsaktivität in Glucose-limitierten Medium	sehr schwach	höher
SO2-Bildung	deutlich > 4 mg/l	wenig < 2 mg/l
weitere Differenzierung	elektrophoretische, immunologische und enzymatische Methoden

Auswahlkriterien für Hefestamm

• Vermehrungsintensität/Hefezuwachs
• Wiederverwendbarkeit
• Angärgeschwindigkeit (Adaptionszeit)
• Kohlenhydrat- und Stickstoffverwertung (Maltotrioseverwertung, Temperatursensitivität)
• Konzentrationsverlauf der schwebenden Hefezellen
• Bruch- und Staubbildung und Sedimentationsverhalten
• Bildung und Abbau von Jungbukettstoffen, Bildung von Aromakomponenten
• pH-Wert-Sturz, -Verlauf
• Beeinflussung Schaumhaltbarkeit und sensorische Qualität des Endbiers
• Streßresistenz gegenüber Prozessparameter

Stressfaktoren

• zelluläre Antwort auf negative Umwelteinflüsse
• Veränderun physiologische Leistung und chemische Zusammensetzung
• Induktion von Streßgenen zur Produktion von Zellprotektoren (z.B. Hitzeschockproteine Trehalose, Glycerin)
• Warmtemperaturschock
  Warmgärung, Warmreifephasen für untergärige Hefestämme (> 15 °C), Anstellen von 4 °C Hefe in 10°C Würze
• Kalttemperaturschock
  Abkühlung von Warmreife auf > 2°C
• Osmotischer Druckwechsel
  Lagerung in Wasser -> Anstellen in Starkbierwürze und andersherum
• Oxidativer Stress
  Überbelüftung, Radikalbildung durch Induktion radikalbildender Enzyme, H₂O₂
• Nährstoffmangel
  Mangelwürzen, Nährstoffmangel durch Würzeinfektion/-sterilisation, lange Lagerung in Wasser oder endvergorende Würzen
• pH-Wertschwankungen
  Säuerung mit H₃PO₄ oder H₂SO₄ auf pH < 2,0
• toxische Stoffe
  Ethanol > 5,0 Vol-%, Desireste, Konservierungsmittelzusätze
• Wasserentzug, Rehydratation
  Press- und Trockenhefenherstellung, Rehydratisierung im Einsatzbetrieb

Aufbau Hefezelle

Bild einfügen

Cytoplasma

• 50 % Zellvolumen, alle Organellen, zahlreiche Ribosomen
• kolloidales System aus Proteinmoleküle
• osmotischer Druck 1,2 MPa durch lösliche Bestandteile

Zellwand mit Plasmamembran

• 100-300 nm mehrschichtig
• 15-30 % der Hefetrockensubstanz
• äußere Zellwand und Plasmamembran

äußere Zellwand

• strukturierte Doppelschicht aus Glucan und Mannan
• Phosphomannanschicht beeinflusst Flockungsvermögen, je mehr desto höher
• Vernetzung über Proteine (Invertase, Melibiase oder Mannase)

Plasmamembran

• lipidartige, fluide Doppelschicht mit Proteinkomplexen (z.B. Permeasen)
• verantwortlich Permeabilität, Aufnahme und Ausscheidung, Osmoregulation und aktiver Stofftransport
• nicht permeabel für meiste Nährstoffe

Mitochondrien

• bei anaerob zurückbildung zu Prämitochondrien
• Bei Teilung teilen sich auch Mitos, Wirkungsort der Atmungsenzyme

Vakuolen

• Anzahl, Größe variabel (Wachstumsstadien, Zellstreß)
• Proteinase A, schlecht für Schaumstabilität (Bildung bei Streß/Lyse)
• Bei High Gravity-Würzen höhere Proteinasen-Konzentration

Größe einer Hefezelle

Zellgröße	2-8 * 4-12	µm
Biotrockenmasse	2-4 * 10-11	g/Zelle
Zellzahl/gHTS	3-4 * 1010	Zellen/gHTS

(1)

\begin{eqnarray} m_{HTS} [g/L] = m_{Zelle} [g/Zelle] \cdot c_{Zellen} [Zellen/L] \\ m_{HTS} = 4 \cdot 10^{-11} g/Zelle \cdot 80 \cdot 10^6 Zellen/mL = 3,2 g/L \end{eqnarray}

Volumen einer Hefezelle mit a = große Halbachse und b = kleine Halbachse

(2)

\begin{align} V_H = \frac{4}{3} \cdot \pi \cdot b^2 \cdot a \end{align}

Einflüsse auf Phänotypen

• physikalisch (Temperatur, Druck, Scherkraft)
• chemisch/biologisch (Medienzusammensetzung, Substratversorgung, osmotischer Druck)

Oberfläche einer Hefezelle

• Stoffaustausch → Stoffwechselintensität, Geschwindigkeit Hefemehrung
• 200 * 10^-12 m³/Zelle
• 1 g Hefe = 0,584 m²

Osmotischer Druck

• normaler Druck 1,2 MPa
• in 12%iger Würze 0,8 MPa -> in Bier (12%, 4%) 2,3 MPa
• Starkbier (16%, 5%) 3,1 MPa

Technologische Konsequenzen

• Schockexkretion beim Wiederanstellen
• Hefevermehrung besser bei wenig Zucker
• Fed batch Verfahren ideal (Brauerei eher Chargenproduktion)

Absetzverhalten

• Hefezeller dichter als Würze

Angestrebtes Sedimentationsverhalten

• Anstellphase (Absetzzeit » Lagphase)
  große Hefeoberfläche, später CO₂-Verteilung
• Klärphase (Absetzzeit < Kaltlagerphase < 7 d)
  Sedimentation, Entlastung der Bierfiltration
• Hefelagerphase (Absetzzeit » Hefelagerdauer)
  Erhaltung gleichmäßiger Konsistenz zur Vermeidung einer Homogenisierung

Berechung Sedimentatinosgeschwindigkeit nach STOKES

• Re < 0,2 (keine turbulente Strömung)
• kugelähnliche Teilchen
• Durchmesser > 0,5 µm (keine BROWN'sche Molekularbewegung)
• Viskosität der Suspension ähnlich Wasser

(3)

\begin{align} Re = \frac{w_0 d \rho}{\eta} \qquad w_0 = \frac{d^2 (\rho_H - \rho) g}{18 \eta} \end{align}

(4)

\begin{align} Ar = \frac{d^3 \rho (\rho_H - \rho) g}{\eta^2} \qquad d_H = \sqrt[3]{\frac{6}{\pi} V} \end{align}

Berechnung der Absatzgeschwindigkeit-Beispiel, siehe Skript. Mal selbst durchrechnen!

Bei Bier ist eine deutliche Erhöhung der Absetzgeschwindigkeit zu beobachten durch Änderung der dyn. Viskosität und der Dichte des Fluids.

Transfer der Nährstoffe in Zelle

• Hülle, Zellwand, Periplasma, Plasmamembran sind zelluläre Hindernisse
• Stoffwechsel ist in verschiedene Reaktionsräume unterteilt
• physikalische Hindernisse wie Komplexbildung, Adsorption, Maskierungen
• Molekülgröße als natürliche Barriere
• spezifische Träger transportieren Stoffe

Transportmechanismen

einfache Diffusion

• passiv
• fettlösliche Substanzen
• Transportrichtung entlang Konzentrationgefälle (Ficksches Gesetz)
• langsam
• Sauerstoff, CO₂ oder Fettsäuren

erleichterte Diffusion

• enzymgesteuert, Bindung an Permease
• Transportrichtung entlang Konzentrationsgefälle (Michaelis-Menten-Kinetik)
• schnell
• auch für größe Moleküle

Diffusionskanäle

• kanal- oder porenbildende Proteine
• je nach Spannungszustand verschiedene Ionen
• in der Regel geschlossen (neg. Pot), offen bei pos. Pot.

aktiver Transport

• Aufnahme Großteil von Nährstoffen unter Energieverbrauch
• ATPase nimmt Nährstoff gegen ein H⁺ auf (wird bei Nährstoffaufnahme wieder eingeführt)
• auch gegen ein Konzentrationsgefälle
• Symport / Antiport

Membranständige ATPase - Protonenpumpe

• ATP -> ADP + P_i + Energie
• Regulation des innerzellulären pH bis 1,5
• verantwortlich für den pH-Sturz zu Beginn Fermentation

Intrazelluläre Verwertung der Nährstoffe

• umgehende Verwertung
• Speicherung
  • im Cytosol (Chelatbildung von Ionen, Veresterung von FS)
  • in Vakuole (Polymerisierung von Phosphaten, Anhäufen von Ca, Mg, Mn, Zn, Aminosäuren)
  • in Lipidtröpfchen (Tricarbonsäuren)

Hauptabschnitte des Stoffwechselwege

Grafik erstelln und einfügen und vielleicht ausführlicher aufschreiben

Schlüsselstellung des Pyruvates

Grafik erstelln und einfügen und vielleicht ausführlicher aufschreiben

Aerober Hefestoffwechsel - Atmung

• oxidative Decarboxylierung: Pyruvat -> Acetyl-CoA
• Kondensation: Oxalacetat + Acetyl-CoA -> Citronensäure
• Regeneration: Citronensäure -> CO₂-Abspaltung, ATP/Redoxäquivalent-Entstehung -> Oxalacetat
• Atmungskette: Regneration der H-Redoxäquivalente
• Hohe Konzentration Citronensäure/Pyruvat hemmen Aktivierung Fructose
• Energiegewinn 38 ATP

Anaerober Stoffwechhsel - Gärung

• Oxidationsreaktion (Dehydrierungen) führen zur Phosphorylierung von ADP
• Wasserstoff auf NAD und NADH gibt ab an Zwischenprodukte des Substratabbaus
• mögliche Produkte: Ethanol, Lactat, Propionat, Formiat, Butyrat, Capronat, Acetat
• Pyruvat -(Lyase)-> Ethanal -(ADH)-> Ethanol

Alkoholdehydrogenase

• Oxidoreduktase
• Isoenzyme
  • ADH1: Acetaldehyd -> Ethanol + CO₂
    4 identische Untereinheiten mit je Bindungsstelle für Coenzym (NADH) und Zinkatom
  • ADH2: Ethanol -> Acetaldehyd (wahrscheinlich)
  • ADH3: lokalisiert in Mitochondrien
• Glucose hemmt ADH2 und ADH3
• sequentieller Reaktionsmechanismus
  • Bindung NADH im aktiven Zentrum
  • Zink polarisiert Carbonylgruppe des Acetaldehyds

Gärungsvarianten

Gärung	MO	Produkt
Alkoholische Gärung	Hefe Zymomonas mobilis Leuconostoc	Ethanol
Milchsäuregärung	Lactobacteriaceae	(homo) Lactat (hetero) Lactat, …
Propionsäuregärung	Propionibacterium	Propionat
gemischte Säuregärung	Enterobacteriaceae	Formiat, …
Buttersäuregärung	Clostridien	Butyrat

Wachstumskurve und Altersverteilung einer Hefepopulation

1. lag-Phase
   • Nährstoffaufnahme
   • keine hefeeigenen Synthesen nötig
   • konstante oder leicht abnehmende Hefezahl -> Viabilität nimmt ab
2. beschleunigtes Wachstum
   • Anpassung an Kulturbedingungen
   • steigende Zellzahlen
3. exponentielle Wachstumsphase
   • optimale Stoffwechsel-Fließgleichgewichte
   • exponentielle Zellvermehrung
   • dauerhaft -> kontinuierliche Hefevermehrung (Backhefeproduktion)
   • kurze Dauer -> diskontinuierliche Batchkulturen (Brauereivermehrung)
4. Wachstumsverlangsamung
   • Abnahme Wachstumsrate durch Nährstofferschöpfung -> Anhäufung toxischer Stoffwechselprodukte
   • keine Abnahme Zellmenge
5. stationäre Phase
   • Zellwachstum und Autolyse im Gleichgewicht
   • Zellautolyse durch Nährstoffmangel und toxische Stoffwechselprodukte
   • keine echte Zellvermehrungsphase
6. Absterbephase
   • Zellauflösung
   • Zellabnahme
   • keine echte Zellvermehrungsphase

• Stationäre und Absterbephase nur bei Brauerei erwünscht, da sekundäre Stoffwechselprodukte wichtig

Diagramm der Wachstumskurve einfügen.

• Nach Teilung Sproßnarben (behindern Stoffaustausch, Oberfläche 2% geringer) bis 25 Narben
• Bei Vermehrung besitzt Population immer gleiche Altersverteilung.

Zellzyklus

• Interphase
  • G0-Phase: optionale Ruhepause ohne Wachstum innerhalb G1-Phase
  • G1-Phase: postmitotische Phase, Wachstum v.a. der Tochterzelle
  • S-Phase: Synthesephase, Replikation der Chromosomen (2 identische Chromatiden)
  • G2-Phase: prämitotische Phase, Vorbereitung für Mitose, verstärkte Synthese von RNA und Proteinen für Zellteilung, Teil des Kerns wandert in Tochterzelle, Chromatiden nahe Sproßregion
• Mitose
  • Karyogenese: Aufteilung der verdoppelten Chromosomen (1 Satz in Mutter, 1 Satz in Tochter)
  • Cytokinese: Abtrennung der Tochterzelle von Mutterzelle

Vermehrungskinetik

Vorüberlegungen
Generationszeit t_G, Anzahl der Generationen n und spezifische Wachstumsrate µ

(5)

\begin{eqnarray} t_G = \frac{t}{n} = \frac{\ln{2}}{\mu} \approx \frac{0,693}{\mu} \\ n = \frac{t}{t_G} \\ \mu = \frac{dX}{dt} \cdot \frac{1}{x} = \frac{\ln{2}}{t_G} \approx \frac{0,693}{t_G} \end{eqnarray}

Zellmenge X_t

(6)

\begin{eqnarray} X_t = X_0 \cdot 2^{\frac{t}{t_G}} \\ \mu = \frac{\ln{X_t} - \ln{X_0}}{t - t_0} \end{eqnarray}

Zuwachsfaktor H

(7)

\begin{align} H = e^{\mu} = e^{\frac{\ln{2}}{t_G}} \qquad t_G = \frac{\ln{2}}{\mu} = \frac{\ln{2}}{H} \end{align}

Prozessdauer t

(8)

\begin{align} t = \frac{t_G(\ln{X_t} - \ln{X_0})}{\ln{2}} \end{align}

Die Beispiele aus dem Skript mal nachrechnen!

Technologisch relevante Stoffwechselregulationsmechanismen

Grundsätzliche Regulationsmechanismen

• Regulation über Kompartimentierung
  Diffusion und Stoffübergang, Enzyme nur in bestimmten Kompartimenten
• Regulation über Enzymkinetik
  Reaktionsgeschwindigkeit gemäß Michaelis-Menten-Kinetik
• Regulation über Enzymaktivität (Hemmung, Allosterie)
  ATP/ADP/AMP-Verhältnis beeinflussen Phosphofructokinase
  Pyruvat-, Citratkonzentration allosterische Hemmung von Phosphofructase
• Regulation über Genexpression
  Transkriptions- und Tranlationsebene
  Induktion oder Repression

Induktion der Maltosepermease und Maltase

• Maltose-Transportsystem (Maltopermease, Maltase) erst nach Adaption an Maltose gebildet
• Repression der Enzyme durch Glucose -> Katabolitrepression
• hoher Glucose-/Saccharoseanteil (über 50%) führt zum Verlust der Maltose/Maltotrioseverwertung oder Lagerung im endvergorenen Bier (wenig Maltose)
• Maltosetransportrate bestimmt Reaktionsgeschwindigkeit

Regulation der Glycolyse

• ATP/ADP/AMP-Verhältnis reguliert Intensität Glycolyse-Stoffwechsel
• Phosphofructokinase gehemmt (allosterisch) von hoher ATP-Konz., aktiviert von kleines ATP/AMP-Verhältnis
• Anreicherung von Pyruvat und Citrat

Crabtree-Effekt

• alkoholische Gärung unter aeroben Bedingungen
• besondere Form der Katabolit-Repression
• Hemmung des reinen Atumungsstoffwechsels bei Glucose-Konz. > 0,1 g/L
• z.B. Hefereinzucht und Propagation -> Ethanolbildung trotz Belüftung
• Sättigung der Pyruvat-Dehydrogenase (respiratorischer Flaschenhals)
  -> Überschuss wird von Pyruvat-Decarboxylase zu Acetaldehyd umgesetzt
• maximale Ausbeute nur durch Zulaufverfahren erreichbar (rein oxidativer Katabolismus)

Pasteureffekt

• Verminderung Gärung bei Luftzutritt zugunsten der Zellatmung
• Energiegewinn der Zelle durch Atmung steigt und senkt Zuckerbedarf
• geringe Bedeutung in Brauereipraxis (nur relevant unter 0,9 g/L Glucose, S. cerevisiae)
• Testmethoden zur Bestimmung des Pasteureffekts
  • Glucose-Bestimmung
    Glucose -> Gluconolacton + H₂O₂; H₂O₂ oxidiert einen Farbstoff
  • Alkohol-Bestimmung -

Ethanol + NAD⁺ -> Acetaldehyd + NADH/H⁺

Custers-Effekt

• Brettanomyces / Dekkera Hefen
• bei Sauerstoffmangel Hemmung der Gärung
• Essigsäurebildung schafft ungünstiges Redox-Verhältnis
• Sauerstoff kann NADH wieder reoxidieren

Kluyver-Effekt

• Candida ssp. / Kluyveromyces ssp.
• Atmung notwendig für den Disaccharidtransport in die Zelle -> keine anaerobe Verstoffwechselung von Disacchariden
• Vorteil: kein Ethanolbildung bei Sauerstofflimitierung (z.B. Hefebiomasse aus Diasaccharid-Substrat Molke)
• keine Bedeutung bei Bierherstellung