Bgp Versuch07 Iex Protan

Ionenaustauscher

• geladene Gruppen und bewegliche Gegenionen
• reversibler Austausch zwischen flüssiger und festen Phase
• Anionenaustauscher bindet Anionen und hat positiv geladene Gruppen
• Kationenaustauscher bindet Kationen und hat negativ geladene Gruppen
• Proteine sind geladen (Amino- und Carboxytermini und saure oder basische Seitenketten)
• Isoelektrischer Punkt an dem Protein nach außen nicht mehr geladen ist
• pH > p_i => negativ (Anionenaustauscher) <=======> pH < p_i => positiv (Kationenaustauscher)
• Bindungsaffinitäten der Proteine sind abhängig von
  • pH-Wert
  • Eigenschaften und Konzentration der übrigen Ionen
  • Typ des Ionenaustauschers
• Auswaschen eines gewünschten Proteins mit Puffer, der pH beim p_i des Proteins hat (Herabsetzung der Affinität)
• Wanderungsgeschwindigkeit wird von Wechselwirkungen mit Säule verlangsamt
• Konzentrations-Gradienten, der Proteine in der Reihenfolge ihrer Affinität eluiert
• geladene Gruppen die kovalent mit Trägermatrix verbunden sind entscheiden über
  • Durchflusscharakteristika
  • Zugänglichkeit
  • Beladungskapazität
  • chemische Stabilität
• Gebräuchliche Trägermaterialen
  • Harze wie Polystyrol
  • Divinybenzol
  • Cellulose
  • vernetzte Polydextran-Gele
  • hoch vernetzte Agarose
• stark sauer-> Sulfon-Säure: negative Ladung pH < 2
• stark basisch-> quartäre Ammoniumionen: positive Ladung pH > 11
• schwach sauer-> Carboxymethylgruppen: negative Ladung pH > 5
• schwach basisch-> Diethylaminoethylgruppen: positive Ladung pH < 8,5
• Im Versuch Q-Sepharose, Agarose Matrix, Trimethylaminomethyl, starker Anionenaustauscher
• Versuchsaufbau
  • Pumpe, Säule, Durchflussphotometer + Schreiber
  • Laufpuffer Tris pH 8,0
  • Durch Erhöhung der Salzkonzentration eluierung aller Proteine von der Säule (Konkurrenz der Ionen)

BCA-Proteinbestimmung

• Proteine mit Cu²⁺ in alkalischer Lösung einen Komplex, dann reduzierung zu Cu¹⁺
• Bei Reduzierung Farbreaktion Biuret-Reaktion
• Bicinchoninsäure (BCA) Nachweis-Reagenz für Cu¹⁺ (Adsorption 562nm) rosa
• Bereich von 20 bis 2000 $\frac{\mu g}{l}$

Bradford-Test

• hydrophobe Bereiche der Proteine binden an an Farbstoffe (aromatische Ringsysteme)
• polarer Farbstoff -> unpolare Proteinphase => Veränderung spektraler Eigenschaften
• Verschiebung in den längerwelligen Bereich, wegen Zunahme der Polarität des Lösungsmittels
• Coomassie-Brilliantblau Veränderung von 465 auf 595nm
• in phosphorsaurer Lösung zwischen 595 und 620nm
• Bereich von 5 und 50 $\mu g$